ПГУ-ын урвалын хөндлөнгийн хүчин зүйлүүд

ПГУ-ын урвалын явцад зарим хөндлөнгийн хүчин зүйлүүд ихэвчлэн тулгардаг.
ПГУ-ын маш өндөр мэдрэмжтэй тул бохирдол нь ПГУ-ын үр дүнд нөлөөлдөг хамгийн чухал хүчин зүйлүүдийн нэг бөгөөд хуурамч эерэг үр дүнг бий болгодог.
Хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэдэг янз бүрийн эх сурвалжууд ч мөн адил чухал юм. Хэрэв ПГУ-ын хольцын нэг буюу хэд хэдэн чухал хэсэг эсвэл олшруулах урвал өөрөө дарангуйлагдсан эсвэл саад болсон тохиолдолд оношлогооны шинжилгээнд саад учруулж болно. Энэ нь үр ашгийг бууруулж, бүр хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэдэг.
Дарангуйлахаас гадна дээж бэлтгэхээс өмнө тээвэрлэх болон/эсвэл хадгалах нөхцлөөс шалтгаалж зорилтот нуклейн хүчлийн бүрэн бүтэн байдал алдагдаж болно. Ялангуяа өндөр температур эсвэл хангалтгүй хадгалалт нь эс, нуклейн хүчлийг гэмтээх аюултай. Эс, эдийг бэхлэх, парафин шингээх нь ДНХ-ийн хуваагдал, байнгын асуудал үүсгэдэг сайн мэддэг шалтгаан юм (Зураг 1, 2-ыг үз). Эдгээр тохиолдолд хамгийн оновчтой тусгаарлалт, цэвэршүүлэх нь ч тус болохгүй.

Зураг 1 | Хөдөлгөөнгүй байдлын ДНХ-ийн бүрэн бүтэн байдалд үзүүлэх нөлөө
Агароз гель электрофорез нь задлан шинжилгээний парафин хэсгүүдээс тусгаарлагдсан ДНХ-ийн чанар ихээхэн ялгаатай болохыг харуулсан. Бэхэлгээний аргаас хамааран ханданд янз бүрийн дундаж фрагментийн урттай ДНХ агуулагдаж байсан. ДНХ нь зөвхөн хөлдөөсөн уугуул дээж болон буферт саармаг формалинд бэхлэгдсэн үед л хадгалагдсан. Хүчтэй хүчиллэг Bouin бэхлэгч эсвэл буфергүй, шоргоолжны хүчил агуулсан формалиныг хэрэглэснээр ДНХ их хэмжээгээр алдагдсан. Үлдсэн хэсэг нь маш их хуваагдсан байна.
Зүүн талд фрагментуудын уртыг килобаазын хосоор (kbp) илэрхийлнэ.

Зураг 2 | Нуклейн хүчлийн зорилтуудын бүрэн бүтэн байдал алдагдах
(a) Хоёр хэлхээн дэх 3′-5′ зай нь зорилтот ДНХ-ийн тасалдалд хүргэдэг. ДНХ-ийн нийлэгжилт нь жижиг фрагмент дээр явагдах болно. Гэсэн хэдий ч хэрэв ДНХ-ийн фрагмент дээр праймер нөхөх хэсэг байхгүй бол зөвхөн шугаман олшруулалт явагдана. Хамгийн таатай тохиолдолд фрагментууд бие биенээ нөхөж болох боловч гарц нь бага, илрүүлэх түвшнээс доогуур байх болно.
(б) Үндсэндээ депуринжуулалт ба тимидин димер үүсэхээс шалтгаалж суурийн алдагдал нь H-бондын тоо буурч, Tm-ийн бууралтад хүргэдэг. Уртасгасан дулааралтын үе шатанд праймерууд нь матрицын ДНХ-ээс хайлж, хатуу ширүүн нөхцөлд ч хатахгүй.
(в) Зэргэлдээх тимин суурь нь TT димер үүсгэдэг.
Молекулын оношлогоонд ихэвчлэн тохиолддог өөр нэг нийтлэг асуудал бол фенол-хлороформын олборлолттой харьцуулахад зорилтот нуклейн хүчлүүдийн оновчтой хэмжээнээс бага ялгарах явдал юм. Онцгой тохиолдолд энэ нь хуурамч сөрөг нөлөөтэй холбоотой байж болно. Эсийн үлдэгдлийг буцалгах эсвэл ферментийн аргаар задлах замаар их цаг хэмнэх боломжтой боловч энэ арга нь нуклейн хүчлийн ялгаралт хангалтгүйгээс ПГУ-ын мэдрэмж багатай байдаг.

Олшруулах явцад полимеразын үйл ажиллагааг дарангуйлах

Ерөнхийдөө дарангуйлал нь ПГУ-ын оновчтой үр дүнд хүргэх бүх хүчин зүйлийг тодорхойлохын тулд савны ойлголт болгон ашигладаг. Хатуу биохимийн утгаараа дарангуйлал нь ферментийн идэвхжилээр хязгаарлагддаг, өөрөөр хэлбэл ДНХ полимеразын идэвхтэй хэсэг эсвэл түүний кофактор (жишээ нь, Так ДНХ полимеразын хувьд Mg2+) -тай харилцан үйлчлэлцэх замаар субстрат-бүтээгдэхүүн хувиргалтыг бууруулж эсвэл сэргийлдэг.
Дээж дэх бүрэлдэхүүн хэсгүүд эсвэл янз бүрийн буфер, урвалж агуулсан хандууд нь ферментийг шууд дарангуйлж, кофакторуудыг (жишээ нь EDTA) барьж, улмаар полимеразыг идэвхгүй болгож, улмаар ПГУ-ын үр дүн буурах эсвэл хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэдэг.
Гэсэн хэдий ч урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүд болон зорилтот бодис агуулсан нуклейн хүчлүүдийн хоорондын олон харилцан үйлчлэлийг "ПГУ-ын дарангуйлагч" гэж нэрлэдэг. Тусгаарлах замаар эсийн бүрэн бүтэн байдал алдагдаж, нуклейн хүчил ялгарсны дараа дээж болон түүний эргэн тойрон дахь уусмал ба хатуу фазын хооронд харилцан үйлчлэл үүсч болно. Жишээлбэл, "цэвэр авагчид" нь ковалент бус харилцан үйлчлэлээр нэг эсвэл хоёр судалтай ДНХ-г холбож, ПГУ-ын урвалын саванд хүрэх зорилтот тоог бууруулж, тусгаарлах, цэвэршүүлэхэд саад учруулдаг.
Ерөнхийдөө ПГУ-ын дарангуйлагчид нь ихэнх биеийн шингэн, эмнэлзүйн оношлогооны шинжилгээнд (шээс дэх мочевин, цусан дахь гемоглобин, гепарин), хүнсний нэмэлт бүтээгдэхүүн (органик бүрэлдэхүүн хэсгүүд, гликоген, өөх тос, Ca2+ ионууд) болон хүрээлэн буй орчны бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд (фенол) ашигладаг урвалжуудад байдаг. , хүнд металлууд)

Илүү өргөн тархсан ПГУ-ын дарангуйлагчийг бактери, эукариот эсүүд, зорилтот бус ДНХ, эдийн матрицын ДНХ холбогч макромолекулууд, бээлий, хуванцар зэрэг лабораторийн тоног төхөөрөмжөөс олж болно. Олборлолтын явцад болон дараа нь нуклейн хүчлийг цэвэршүүлэх нь ПГУ-ын дарангуйлагчийг арилгах хамгийн тохиромжтой арга юм.
Өнөөдөр янз бүрийн автоматжуулсан олборлох төхөөрөмж нь гарын авлагын олон протоколыг орлож чадах боловч зорилтот объектыг 100% сэргээх ба/эсвэл цэвэршүүлэхэд хэзээ ч хүрч чадаагүй байна. Боломжит дарангуйлагч нь цэвэршүүлсэн нуклейн хүчилд агуулагдах эсвэл аль хэдийн нөлөөлсөн байж болно. Дарангуйлагчдын нөлөөг бууруулах өөр өөр стратеги байдаг. Тохиромжтой полимеразыг сонгох нь дарангуйлагчийн үйл ажиллагаанд ихээхэн нөлөөлдөг. ПГУ-ын дарангуйллыг бууруулах бусад батлагдсан аргууд бол полимеразын концентрацийг нэмэгдүүлэх эсвэл BSA зэрэг нэмэлт бодис хэрэглэх явдал юм.
ПГУ-ын урвалыг дарангуйлах нь дотоод процессын чанарын хяналтыг (IPC) ашиглах замаар харуулж болно.
Этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол, фенол зэрэг экстракцийн иж бүрдэл дэх бүх урвалж болон бусад уусмалыг нуклейн хүчлийн тусгаарлалтаас сайтар угааж цэвэрлэхэд анхаарах хэрэгтэй. Тэдний концентрациас хамааран тэдгээр нь ПГУ-ыг идэвхжүүлж эсвэл дарангуйлж болно.