ПГУ-ын урвал дахь хөндлөнгийн хүчин зүйлс

ПГУ-ын урвалын үед зарим саад учруулж буй хүчин зүйлүүд ихэвчлэн тулгардаг.
ПГУ-ын маш өндөр мэдрэг чанараас шалтгаалан бохирдол нь ПГУ-ын үр дүнд нөлөөлдөг хамгийн чухал хүчин зүйлсийн нэг гэж тооцогддог бөгөөд хуурамч эерэг үр дүн өгч болзошгүй.
Хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэдэг янз бүрийн эх үүсвэрүүд нь мөн адил чухал юм. Хэрэв ПГУ-ын хольцын нэг буюу хэд хэдэн чухал хэсэг эсвэл олшруулах урвал нь өөрөө дарангуйлагдсан эсвэл хөндлөнгөөс оролцсон бол оношлогооны шинжилгээнд саад учруулж болзошгүй. Энэ нь үр ашгийг бууруулж, тэр ч байтугай хуурамч сөрөг үр дүнд хүргэж болзошгүй юм.
Дарангуйлахаас гадна дээж бэлтгэхээс өмнө тээвэрлэлт болон/эсвэл хадгалах нөхцлөөс шалтгаалан бай нуклейн хүчлийн бүрэн бүтэн байдал алдагдах тохиолдол гардаг. Ялангуяа өндөр температур эсвэл хангалтгүй хадгалалт нь эс болон нуклейн хүчлийг гэмтээхэд хүргэдэг. Эс болон эд эсийг бэхлэх, парафиныг оруулах нь ДНХ-ийн хуваагдлын сайн мэддэг шалтгаан бөгөөд байнгын асуудал юм (Зураг 1 ба 2-ыг үзнэ үү). Эдгээр тохиолдолд оновчтой тусгаарлалт болон цэвэршүүлэлт ч тус болохгүй.

Зураг 1 | Хөдөлгөөнгүй байдлын ДНХ-ийн бүрэн бүтэн байдалд үзүүлэх нөлөө
Агароз гель электрофорезоор задлан шинжилгээний парафины хэсгээс ялгаж авсан ДНХ-ийн чанар мэдэгдэхүйц ялгаатай байгааг харуулсан. Фиксация хийх аргаас хамааран ханданд өөр өөр дундаж фрагментийн урттай ДНХ байсан. ДНХ нь зөвхөн уугуул хөлдөөсөн дээжинд болон буфержуулсан саармаг формалинд фиксжсэн үед л хадгалагдсан. Хүчтэй хүчиллэг Буин фиксатор эсвэл буфержуулаагүй, шоргоолжны хүчил агуулсан формалиныг хэрэглэснээр ДНХ мэдэгдэхүйц алдагдалд орсон. Үлдсэн фракц нь маш их фрагментжсэн байна.
Зүүн талд, хэлтэрхийнүүдийн уртыг килобазын хосоор (kbp) илэрхийлнэ.

Зураг 2 | Нуклейн хүчлийн байнуудын бүрэн бүтэн байдал алдагдах
(a) Хоёр хэлхээний 3′-5′ зай нь бай ДНХ-д тасрахад хүргэнэ. ДНХ-ийн нийлэгжилт жижиг хэлтэрхий дээр явагдах болно. Гэсэн хэдий ч хэрэв ДНХ-ийн хэлтэрхий дээр праймерын хайлуулах хэсэг байхгүй бол зөвхөн шугаман олшруулалт явагдана. Хамгийн таатай тохиолдолд хэлтэрхий нь бие биенээ дахин ханаж болох боловч гарц нь бага бөгөөд илрүүлэх түвшингээс доогуур байх болно.
(b) Үндсэндээ цэвэршилт болон тимидин димер үүссэнээс үүдэлтэй суурийн алдагдал нь H-холбооны тоо буурч, Tm буурахад хүргэдэг. Уртасгасан дулаарлын үе шатанд праймерууд нь матрицын ДНХ-ээс хайлж, илүү хатуу нөхцөлд ч халахгүй.
(в) Зэргэлдээ тимины суурь нь TT димер үүсгэдэг.
Молекулын оношлогоонд ихэвчлэн тохиолддог бас нэг нийтлэг асуудал бол фенол-хлороформ гаргаж авахтай харьцуулахад зорилтот нуклейн хүчлүүдийн ялгаруулалт оновчтой бус байдаг явдал юм. Онцгой тохиолдолд энэ нь хуурамч сөрөг үр дүнтэй холбоотой байж болно. Буцалгах лизис эсвэл эсийн үлдэгдлийг ферментийн аргаар задалснаар их цаг хэмнэж болох боловч энэ арга нь нуклейн хүчлийн ялгаруулалт хангалтгүй байгаагаас болж PCR-ийн мэдрэг чанар багатай байдаг.

Олшруулах явцад полимеразын идэвхжилийг дарангуйлах

Ерөнхийдөө дарангуйллыг PCR-ийн үр дүн муутай болоход хүргэдэг бүх хүчин зүйлийг тодорхойлох контейнер ойлголт болгон ашигладаг. Зөвхөн биохимийн утгаараа дарангуйлал нь ферментийн идэвхжилээр хязгаарлагддаг, өөрөөр хэлбэл ДНХ полимераза эсвэл түүний кофакторын идэвхтэй хэсэгтэй (жишээлбэл, Taq ДНХ полимеразад зориулсан Mg2+) харилцан үйлчлэлцэх замаар субстрат-бүтээгдэхүүний хувирлыг бууруулдаг эсвэл урьдчилан сэргийлдэг.
Дээжийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд эсвэл урвалж агуулсан янз бүрийн буфер болон хандууд нь ферментийг шууд дарангуйлах эсвэл түүний кофакторуудыг (жишээ нь EDTA) барьж, улмаар полимеразыг идэвхгүйжүүлж, улмаар ПГУ-ын үр дүнг бууруулах эсвэл хуурамч сөрөг болгоход хүргэдэг.
Гэсэн хэдий ч урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүд болон бай агуулсан нуклейн хүчлүүдийн хоорондох олон харилцан үйлчлэлийг "PCR дарангуйлагч" гэж нэрлэдэг. Эсийн бүрэн бүтэн байдал тусгаарлалтаар алдагдаж, нуклейн хүчил ялгарсны дараа дээж болон түүнийг хүрээлсэн уусмал болон хатуу фазын хооронд харилцан үйлчлэл үүсч болно. Жишээлбэл, "хог хаягдал" нь ковалент бус харилцан үйлчлэлээр дамжуулан дан эсвэл давхар судалтай ДНХ-тэй холбогдож, эцэст нь PCR урвалын саванд хүрэх байнуудын тоог бууруулснаар тусгаарлалт болон цэвэршүүлэлтэд саад учруулж болно.
Ерөнхийдөө ПГУ-ын дарангуйлагчид нь клиник оношлогооны шинжилгээнд ашигладаг ихэнх биеийн шингэн болон урвалжууд (шээсний мочевин, цусан дахь гемоглобин ба гепарин), хоолны нэмэлт тэжээл (органик бүрэлдэхүүн хэсэг, гликоген, өөх тос, Ca2+ ионууд) болон хүрээлэн буй орчны бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд (фенол, хүнд металлууд) агуулагддаг.

Илүү түгээмэл тохиолддог ПГУ-ын дарангуйлагчдыг бактери ба эукариот эсүүд, зорилтот бус ДНХ, эдийн матрицын ДНХ-тэй холбогддог макромолекулууд болон бээлий, хуванцар зэрэг лабораторийн тоног төхөөрөмжөөс олж болно. ПГУ-ын дарангуйлагчийг зайлуулах явцад эсвэл дараа нь нуклейн хүчлийг цэвэршүүлэх нь илүү тохиромжтой арга юм.
Өнөөдөр янз бүрийн автоматжуулсан олборлолтын тоног төхөөрөмж нь олон гарын авлагын протоколыг орлож чаддаг боловч байг 100% сэргээх болон/эсвэл цэвэршүүлэх ажлыг хэзээ ч хийж байгаагүй. Цэвэршүүлсэн нуклейн хүчлүүдэд болзошгүй дарангуйлагчид байсаар байж болох эсвэл аль хэдийн үр дүнтэй болсон байж магадгүй юм. Дарангуйлагчдын нөлөөллийг бууруулах өөр өөр стратегиуд байдаг. Тохирох полимеразыг сонгох нь дарангуйлагчийн үйл ажиллагаанд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлж болно. ПГУ-ын дарангуйллыг бууруулах бусад батлагдсан аргууд бол полимеразын концентрацийг нэмэгдүүлэх эсвэл BSA зэрэг нэмэлтүүдийг хэрэглэх явдал юм.
ПГУ-ын урвалыг дарангуйлахыг дотоод процессын чанарын хяналт (IPC) ашиглан харуулж болно.
Нуклейн хүчлийн изолятаас этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол, фенол зэрэг бүх урвалж болон бусад уусмалыг сайтар угаах алхамаар зайлуулах шаардлагатай. Тэдгээрийн концентрацаас хамааран тэдгээр нь ПГУ-г идэвхжүүлэх эсвэл дарангуйлах боломжтой.